Kiedy warto składać genom bakteryjny

data2biology składa genomy bakteryjne de novo z danych Illumina, Oxford Nanopore i PacBio, dochodząc — przy odpowiedniej jakości materiału — do domkniętego chromosomu wraz z plazmidami, a następnie uzupełnia je o adnotację funkcjonalną oraz wykrywanie genów oporności i wirulencji. Genom bakteryjny to zwykle jeden kolisty chromosom o wielkości kilku milionów par zasad, czasem z dodatkowymi plazmidami. Przy odpowiednich danych da się go dziś domknąć do pojedynczych, kompletnych sekwencji, a nie tylko do zbioru kontigów. Taki genom jest podstawą do charakterystyki nowego izolatu, opisu szczepu w publikacji, analizy genów oporności, śledzenia epidemiologicznego czy porównań pangenomowych.

Pracujemy z danymi krótkoodczytowymi (Illumina), długoodczytowymi (Oxford Nanopore, PacBio) oraz hybrydowymi. Domknięcie genomu w praktyce wymaga odczytów długich — same odczyty Illumina zwykle zatrzymują się na kilkudziesięciu kontigach ze względu na powtórzenia, przede wszystkim operony rRNA.

Przebieg analizy

Poniżej opisujemy schemat, według którego typowo prowadzimy tego rodzaju analizy. Nie jest to sztywna procedura: dobór narzędzi zależy od organizmu, typu biblioteki, głębokości sekwencjonowania i pytania badawczego, a standardy w bioinformatyce zmieniają się szybko. Metodykę uzgadniamy z Tobą przed startem projektu i aktualizujemy wraz z rozwojem narzędzi oraz baz referencyjnych.

Dane wejściowe

Odczyty Illumina i/lub ONT/PacBio (FASTQ) · informacja o gatunku lub rodzaju · opcjonalnie genom referencyjny bliskiego szczepu

Kontrola jakości odczytów

Osobne metryki dla odczytów krótkich i długich, ocena rozkładu długości i pokrycia oraz wykrycie zanieczyszczeń obcym materiałem.

FastQCMultiQCNanoPlotKraken2

Przycinanie i filtrowanie

Usunięcie adapterów i odczytów niskiej jakości. Dla odczytów długich zwykle ograniczamy zestaw do najdłuższych i najlepszych, zamiast używać wszystkich.

fastpPorechopFiltlong

Składanie genomu

Dobór asemblera zależy od typu danych: hybrydowy dla zestawu Illumina + ONT, długoodczytowy dla samych odczytów długich, grafowy dla samej Illuminy.

UnicyclerFlyeSPAdesRaven

Polerowanie sekwencji

Korekta błędów pojedynczych zasad i indeli, szczególnie istotna przy danych nanoporowych, gdzie nieskorygowane indele psują ramki odczytu.

MedakaRaconPolypolishPilon

Ocena jakości złożenia

Statystyki ciągłości, kompletność zestawu genów jednokopijnych oraz oszacowanie zanieczyszczenia i domknięcia genomu.

QUASTBUSCOCheckM2

Adnotacja strukturalna i funkcjonalna

Wyznaczenie genów kodujących białka, rRNA, tRNA i innych ncRNA oraz przypisanie im produktów, numerów EC i kategorii funkcjonalnych.

BaktaProkkaInterProScaneggNOG-mapper

Charakterystyka szczepu

Identyfikacja taksonomiczna, wykrycie plazmidów oraz genów oporności i wirulencji — zakres ustalamy zależnie od celu projektu.

GTDB-TkAMRFinderPlusPlasmidFinderMOB-suite

Raport i przygotowanie do deponowania

Zestawienie wyników oraz pliki w formacie wymaganym przez NCBI lub ENA, jeśli genom ma trafić do publicznej bazy.

NCBI table2asnMultiQC

Wyniki

Sekwencja genomu i plazmidów · adnotacja GFF3/GenBank · białka i geny · tabele adnotacji i oporności · raporty jakości

Typowy przepływ danych przy składaniu genomu bakteryjnego. Etapy 3 i 4 dobieramy zależnie od dostępnego typu odczytów.

Na co zwracamy uwagę

Domknięcie genomu a liczba kontigów

Nie każdy projekt potrzebuje zamkniętego genomu. Do typowania szczepu czy przeszukiwania pod kątem genów oporności w zupełności wystarcza złożenie szkicowe z kilkudziesięciu kontigów. Domknięcie ma znaczenie, gdy interesuje Cię struktura plazmidów, kontekst genomowy wysp patogenności albo liczba kopii operonów rRNA. Mówimy wprost, kiedy dokładanie danych ma sens, a kiedy byłoby wydatkiem bez zysku informacyjnego.

Zanieczyszczenia w hodowli

Przed składaniem sprawdzamy skład taksonomiczny odczytów. Zanieczyszczenie inną bakterią lub materiałem gospodarza potrafi wygenerować kontigi, które wyglądają jak fascynujący transfer horyzontalny, a w rzeczywistości są artefaktem hodowli. Wynik takiej kontroli zawsze pokazujemy w raporcie, także wtedy gdy jest czysty.

Adnotacja to predykcja, nie pomiar

Przypisania funkcji pochodzą z porównania do baz referencyjnych, a te zawierają zarówno adnotacje eksperymentalne, jak i przewidywane. Znaczna część genów bakteryjnych dostaje opis typu „hypothetical protein" i jest to uczciwy wynik, a nie brak staranności. W tabelach zaznaczamy źródło i pewność przypisania, żeby dało się odróżnić hit do scharakteryzowanego białka od dopasowania do rodziny domenowej.

Co otrzymujesz

Plik	Format	Co zawiera
assembly.fasta	FASTA	Sekwencja genomu. Przy złożeniu domkniętym każdy rekord to osobna cząsteczka. chromosome — chromosom, z adnotacją o kolistości w nagłówku plasmid_1, plasmid_2, … — plazmidy z podaną długością i pokryciem
annotation.gff3	GFF3	Adnotacja w formacie tekstowym, po jednej cesze na wiersz, dziewięć kolumn rozdzielonych tabulatorami. Wczytasz ją do IGV, Artemis, JBrowse lub Biopythona. seqid, source — kontig oraz narzędzie, które wygenerowało wpis type — CDS, gene, tRNA, rRNA, tmRNA, ncRNA start, end, strand — współrzędne i orientacja na kontigu attributes — ID, locus_tag, gene, product, EC_number, odnośniki do baz zewnętrznych
annotation.gbk	GenBank	Ten sam zestaw adnotacji z sekwencją w jednym pliku — format czytany przez Artemis, SnapGene i Geneious.
proteins.faa / genes.ffn	FASTA	Sekwencje aminokwasowe wszystkich przewidzianych białek oraz nukleotydowe sekwencje genów, gotowe do własnych analiz porównawczych.
annotation_table.xlsx	XLSX	Cała adnotacja w formie arkusza, po jednym wierszu na gen — plik, do którego zagląda się najczęściej. locus_tag, kontig, start, koniec, nić, długość w pz i aa gene, product — nazwa genu i opis produktu EC_number, KEGG KO, kategoria COG, terminy GO Źródło adnotacji i miara podobieństwa do rekordu referencyjnego
strain_report.xlsx	XLSX	Charakterystyka szczepu, zakres zależny od uzgodnień. Przypisanie taksonomiczne i odległość do najbliższego genomu referencyjnego Geny oporności: nazwa, klasa antybiotyku, identyczność, pokrycie, lokalizacja Czynniki wirulencji i wykryte replikony plazmidowe
quality/	HTML + TSV	Komplet raportów jakości. QUAST: liczba kontigów, całkowita długość, N50, zawartość GC BUSCO i CheckM2: kompletność oraz oszacowane zanieczyszczenie MultiQC: statystyki odczytów przed i po filtrowaniu
methods.docx	DOCX	Szkic sekcji metod z wersjami narzędzi, parametrami i cytowaniami, gotowy do wklejenia do manuskryptu.

Czego potrzebujemy od Ciebie

Surowe pliki FASTQ — dla ONT dodatkowo informację o wersji zestawu i modelu basecallingu
Gatunek lub przynajmniej rodzaj, jeśli jest znany, oraz pochodzenie izolatu
Informację, czy oczekujesz złożenia szkicowego czy próby domknięcia genomu
Zakres charakterystyki szczepu: oporność, wirulencja, plazmidy, pangenom
Informację, czy genom ma trafić do NCBI lub ENA — przygotujemy pliki zgodne z wymaganiami

Wycena i współpraca

Każdy projekt wyceniamy indywidualnie. Koszt zależy przede wszystkim od liczby próbek, dostępności genomu referencyjnego, liczby porównań i zakresu analiz, o które prosisz.

Piszesz do nas, co chcesz zbadać i jakimi danymi dysponujesz.
Jeśli coś wymaga doprecyzowania, umawiamy krótką rozmowę — bezpłatnie i bez zobowiązań.
W ciągu 3–5 dni roboczych dostajesz wycenę wraz z zakresem prac, listą plików wynikowych i terminem realizacji.
Decydujesz. Wycena jest niezobowiązująca.

Zakres i koszt tego typu projektów różnią się na tyle mocno, że podanie jednej reprezentatywnej kwoty byłoby mylące. Jeśli potrzebujesz rzędu wielkości jeszcze przed formalną wyceną, napisz — orientacyjny przedział podamy od ręki.

Podane kwoty są orientacyjne, wyrażone w wartościach netto; do ceny doliczamy podatek VAT zgodnie z obowiązującymi przepisami. Nie stanowią one oferty w rozumieniu Kodeksu cywilnego. Więcej o zasadach współpracy w FAQ.

Składanie genomu de novo — bakterie