Kiedy warto sięgnąć po small RNA-Seq

data2biology analizuje dane small RNA-Seq: identyfikuje znane i nowe miRNA, bada ich ekspresję różnicową i przewiduje geny docelowe, stosując odrębne kryteria dla organizmów roślinnych i zwierzęcych. Orientacyjny koszt projektu obejmującego od 10 do 20 próbek to 3 500–4 000 zł netto (stan na 2026 rok). Małe RNA regulują ekspresję genów na poziomie potranskrypcyjnym i uczestniczą w odpowiedzi na stres, rozwoju, obronie przed wirusami oraz wyciszaniu transpozonów. Analiza small RNA-Seq pozwala zidentyfikować, które z nich są obecne w badanym materiale, które zmieniają poziom między warunkami i jakie geny mogą być ich celem.

Analizujemy dane zarówno zwierzęce, jak i roślinne. To rozróżnienie ma znaczenie praktyczne: kryteria uznania cząsteczki za miRNA, oczekiwane długości oraz metody predykcji celów różnią się między tymi grupami na tyle, że stosowanie narzędzi zwierzęcych do danych roślinnych daje wyniki mylące.

Przebieg analizy

Poniżej opisujemy schemat, według którego typowo prowadzimy tego rodzaju analizy. Nie jest to sztywna procedura: dobór narzędzi zależy od organizmu, typu biblioteki, głębokości sekwencjonowania i pytania badawczego, a standardy w bioinformatyce zmieniają się szybko. Metodykę uzgadniamy z Tobą przed startem projektu i aktualizujemy wraz z rozwojem narzędzi oraz baz referencyjnych.

Dane wejściowe

Pliki FASTQ (zwykle jednokońcowe) · sekwencja użytego adaptera 3' · genom referencyjny lub transkryptom · tabela metadanych próbek

Przycinanie adapterów i kontrola jakości

Etap krytyczny: insert ma zwykle 20–24 nukleotydy, więc adapter zajmuje większość odczytu. Błąd na tym etapie unieważnia całą dalszą analizę.

cutadaptfastpFastQCMultiQC

Rozkład długości i filtrowanie

Sprawdzamy, czy widoczny jest oczekiwany pik długości, i odfiltrowujemy fragmenty rRNA, tRNA, snoRNA oraz snRNA, które nie są przedmiotem analizy.

bowtieRfamSortMeRNA

Mapowanie do genomu

Mapowanie krótkich sekwencji wymaga innych ustawień niż standardowy RNA-Seq, w tym kontrolowanego traktowania odczytów mapujących się w wielu miejscach.

bowtieShortStack

Identyfikacja miRNA znanych i nowych

Znane miRNA rozpoznajemy przez porównanie z bazą referencyjną, nowe — na podstawie struktury drugorzędowej prekursora i wzoru odczytów typowego dla cięcia przez Dicer.

miRDeep2ShortStacksRNAbenchmiRBase

Kwantyfikacja i normalizacja

Zliczenia dla każdego miRNA i klastra small RNA, znormalizowane metodą odpowiednią dla danych zliczeniowych o silnie skośnym rozkładzie.

ShortStackDESeq2

Ekspresja różnicowa

Porównanie poziomów między warunkami z korektą na testowanie wielokrotne, analogicznie do standardowego RNA-Seq.

DESeq2edgeR

Analiza isomiR i modyfikacji

Warianty długości i sekwencji dojrzałego miRNA oraz zdarzenia dodawania nukleotydów na końcu 3' — o ile są przedmiotem Twojego pytania badawczego.

isomiRsQuagmiR

Predykcja genów docelowych

Metoda zależy od grupy organizmów: u roślin parowanie jest niemal doskonałe i predykcja jest wiarygodna, u zwierząt opiera się na krótkim regionie zarodkowym i daje znacznie więcej wyników fałszywie dodatnich.

psRNATargetTargetScanmiRandaRNAhybrid

Wizualizacja i raport

Wykresy rozkładów długości, ekspresji i struktur prekursorów oraz raport opisujący przyjęte kryteria.

ggplot2ComplexHeatmapR Markdown

Wyniki

Tabele miRNA znanych i nowych · zliczenia i wyniki ekspresji różnicowej · predykcje celów · wykresy · pliki mapowań

Typowy przepływ danych w projekcie small RNA-Seq. Etapy 7 i 8 wykonujemy zależnie od zakresu uzgodnionego na starcie.

Na co zwracamy uwagę

Adapter musi być znany

Przy insercie o długości około 22 nukleotydów i odczycie o długości 50, adapter stanowi ponad połowę sekwencji. Jeśli sekwencja adaptera nie jest znana, próbujemy ją odtworzyć z danych, ale jest to obejście, nie rozwiązanie. Warto uzyskać tę informację od jednostki sekwencjonującej.

Nowe miRNA to kandydaci, nie odkrycia

Przewidziane nowe miRNA raportujemy jako kandydatów wraz z miarami pewności: strukturą prekursora, obecnością nici gwiazdkowej i liczbą wspierających odczytów. Potwierdzenie wymaga walidacji eksperymentalnej. Zaznaczamy to wyraźnie, ponieważ listy kandydatów bywają w publikacjach przedstawiane jako pewne wyniki.

Ostrożność przy predykcji celów u zwierząt

Algorytmy przewidują u zwierząt setki potencjalnych celów dla pojedynczego miRNA i większość z nich nigdy nie potwierdza się eksperymentalnie. Podajemy wyniki wraz z miarami wiarygodności i konserwatywności ewolucyjnej, a w raporcie sugerujemy, które kandydaty najbardziej opłaca się zweryfikować, zamiast przekazywać surową listę o długości kilku tysięcy wierszy.

Co otrzymujesz

Plik	Format	Co zawiera
multiqc_report.html	HTML	Raport jakości wszystkich próbek wraz z rozkładami długości po przycięciu adapterów — pierwszy plik, do którego warto zajrzeć. Liczba odczytów surowych, po przycięciu i po filtrowaniu Rozkład długości insertów z widocznym pikiem charakterystycznym dla miRNA Udział poszczególnych klas small RNA w każdej próbce
known_miRNA_counts.tsv	TSV	Macierz zliczeń dla miRNA obecnych w bazie referencyjnej: wiersze to miRNA, kolumny to próbki.
novel_miRNA_candidates.xlsx	XLSX	Kandydaci na nowe miRNA wraz z pełnym zestawem dowodów, żeby dało się ocenić wiarygodność każdego wpisu samodzielnie. Identyfikator roboczy, lokalizacja w genomie i nić Sekwencja dojrzała, sekwencja gwiazdkowa i sekwencja prekursora Struktura drugorzędowa prekursora oraz jego minimalna energia swobodna Liczba odczytów wspierających i miara pewności predykcji Podobieństwo do znanych rodzin miRNA u pokrewnych gatunków
DE_miRNA.xlsx	XLSX	Ekspresja różnicowa małych RNA, po jednej zakładce na porównanie. miRNA_id, baseMean, log2FoldChange, lfcSE pvalue, padj oraz kierunek zmiany Zakładka „parameters" z wersjami narzędzi i użytymi progami
target_predictions.xlsx	XLSX	Przewidywane geny docelowe, uszeregowane według wiarygodności. miRNA oraz identyfikator i symbol genu docelowego Pozycja miejsca wiązania w transkrypcie i typ parowania Miara dopasowania i energia hybrydyzacji Konserwacja miejsca u pokrewnych gatunków, jeśli dane są dostępne Terminy GO wzbogacone wśród przewidywanych celów
figures/	PNG + PDF	Wykresy w rozdzielczości publikacyjnej i wektorowe. Rozkłady długości small RNA w podziale na próbki PCA, wykres volcano i mapa cieplna miRNA Struktury drugorzędowe prekursorów nowych kandydatów
alignments/.bam + .bai	BAM	Zmapowane odczyty z indeksami — pozwalają obejrzeć wzór pokrycia w obrębie prekursora w przeglądarce genomu.
methods.docx	DOCX	Szkic sekcji metod z wersjami narzędzi, kryteriami identyfikacji miRNA i cytowaniami.

Czego potrzebujemy od Ciebie

Surowe pliki FASTQ, bez wcześniejszego przycinania adapterów
Sekwencję adaptera 3' oraz nazwę zestawu użytego do przygotowania biblioteki
Gatunek i informację, czy chodzi o organizm roślinny czy zwierzęcy
Tabelę próbek z przypisaniem do grup eksperymentalnych
Informację, czy interesuje Cię predykcja celów i analiza isomiR, czy sama ekspresja

Wycena i współpraca

Każdy projekt wyceniamy indywidualnie. Koszt zależy przede wszystkim od liczby próbek, dostępności genomu referencyjnego, liczby porównań i zakresu analiz, o które prosisz.

Piszesz do nas, co chcesz zbadać i jakimi danymi dysponujesz.
Jeśli coś wymaga doprecyzowania, umawiamy krótką rozmowę — bezpłatnie i bez zobowiązań.
W ciągu 3–5 dni roboczych dostajesz wycenę wraz z zakresem prac, listą plików wynikowych i terminem realizacji.
Decydujesz. Wycena jest niezobowiązująca.

Czego się spodziewać

Dla orientacji: analiza small RNA-Seq dla 10–20 próbek, obejmująca identyfikację znanych i nowych miRNA oraz analizę ekspresji różnicowej, to zwykle koszt rzędu 3 500–4 000 zł netto. Predykcję genów docelowych i analizę isomiR wyceniamy osobno, ponieważ ich pracochłonność zależy od organizmu i liczby cząsteczek objętych analizą.

Podane kwoty są orientacyjne, wyrażone w wartościach netto; do ceny doliczamy podatek VAT zgodnie z obowiązującymi przepisami. Nie stanowią one oferty w rozumieniu Kodeksu cywilnego. Więcej o zasadach współpracy w FAQ.