Kiedy warto sięgnąć po RNA-Seq

data2biology wykonuje analizę RNA-Seq w całości: od surowych plików FASTQ po listę genów ulegających ekspresji różnicowej (DEG) wraz z analizą wzbogacenia GO i KEGG. Projekt obejmujący od 10 do 20 próbek trwa zwykle około czterech tygodni, a jego orientacyjny koszt to 4 500 zł netto (stan na 2026 rok). RNA-Seq odpowiada na pytanie, które geny zmieniają aktywność między warunkami: traktowanie wobec kontroli, tkanka wobec tkanki, punkt czasowy wobec punktu czasowego, linia zmutowana wobec typu dzikiego. Poza samą listą genów ulegających ekspresji różnicowej (DEG) analiza daje kontekst funkcjonalny, czyli informację, jakie procesy biologiczne i szlaki metaboliczne są w tych zmianach nadreprezentowane.

Pracujemy zarówno z organizmami modelowymi, dla których istnieje dobrze zaadnotowany genom referencyjny, jak i niemodelowymi, gdzie punktem wyjścia bywa transkryptom składany de novo. Obsługujemy dane jedno- i dwukońcowe, biblioteki niciowane i nieniciowane, a także eksperymenty z wieloma czynnikami lub seriami czasowymi.

Przebieg analizy

Poniżej opisujemy schemat, według którego typowo prowadzimy tego rodzaju analizy. Nie jest to sztywna procedura: dobór narzędzi zależy od organizmu, typu biblioteki, głębokości sekwencjonowania i pytania badawczego, a standardy w bioinformatyce zmieniają się szybko. Metodykę uzgadniamy z Tobą przed startem projektu i aktualizujemy wraz z rozwojem narzędzi oraz baz referencyjnych.

Dane wejściowe

Pliki FASTQ (R1/R2) · genom referencyjny i adnotacja (FASTA + GTF/GFF3) · tabela metadanych próbek

Kontrola jakości odczytów

Rozkład jakości zasad, zawartość adapterów, duplikacja, poziom zanieczyszczeń. Wyniki wszystkich próbek zbieramy w jeden raport zbiorczy.

FastQCMultiQC

Przycinanie i filtrowanie

Usunięcie adapterów i zasad o niskiej jakości, opcjonalnie odfiltrowanie odczytów rRNA lub zanieczyszczeń z innych organizmów.

fastpTrimmomaticcutadaptSortMeRNA

Mapowanie lub pseudomapowanie

Przy dostępnym genomie mapujemy odczyty z uwzględnieniem miejsc splicingowych. Gdy interesuje nas wyłącznie poziom ekspresji, szybszą alternatywą jest kwantyfikacja bez pełnego mapowania.

STARHISAT2Salmonkallisto

Zliczanie odczytów na gen i transkrypt

Macierz zliczeń geny × próbki, a przy pytaniach o izoformy również poziom transkryptów.

featureCountsHTSeq-countStringTietximport

Kontrola jakości eksperymentu

PCA, korelacje między powtórzeniami i klastrowanie próbek. Ten etap wychwytuje zamienione etykiety, odstające powtórzenia i batch effect, zanim wpłyną na wyniki.

DESeq2 (vst/rlog)PCAComplexHeatmap

Analiza ekspresji różnicowej

Model oparty na ujemnym rozkładzie dwumianowym, poprawka na wielokrotne testowanie metodą Benjaminiego–Hochberga, w razie potrzeby uwzględnienie czynników zakłócających w modelu.

DESeq2edgeRlimma-voom

Analiza wzbogacenia funkcjonalnego

Nadreprezentacja terminów GO i szlaków KEGG wśród genów DEG, uzupełniona analizą GSEA na pełnym, uszeregowanym zestawie genów.

clusterProfilergProfiler2fgseatopGO

Wizualizacja i raport

Wykresy publikacyjne w formatach rastrowych i wektorowych oraz raport opisujący założenia, użyte parametry i ostrożne podsumowanie wyników.

ggplot2ComplexHeatmapR Markdown

Wyniki

Tabele ekspresji i genów DEG · wyniki wzbogacenia · wykresy · pliki BAM i ścieżki bigWig · raport i opis metod

Typowy przepływ danych w projekcie RNA-Seq. Etapy 3 i 4 dobieramy zależnie od tego, czy dostępny jest genom referencyjny.

Na co zwracamy uwagę

Projekt eksperymentu i powtórzenia

Liczba powtórzeń biologicznych wpływa na wyniki mocniej niż wybór narzędzia. Przy trzech powtórzeniach na grupę wykrywamy wyraźne zmiany, ale słabsze efekty pozostają poza zasięgiem statystyki. Jeśli eksperyment jest dopiero planowany, chętnie omówimy liczebność grup i głębokość sekwencjonowania, zanim pojawią się dane — to najtańszy moment na taką rozmowę.

Progi istotności

Domyślnie za geny DEG uznajemy te ze skorygowaną wartością p poniżej 0,05 i wartością bezwzględną log₂ krotności zmiany co najmniej 1. Progi te są jednak kwestią umowy, nie prawa natury — jeżeli w Twojej dziedzinie przyjęte są inne, stosujemy je i zawsze raportujemy, jakie wartości zostały użyte.

Organizmy niemodelowe

Bez genomu referencyjnego zaczynamy od złożenia transkryptomu de novo i jego adnotacji funkcjonalnej na podstawie podobieństwa do baz białkowych. Interpretacja jest wtedy ostrożniejsza, ponieważ część transkryptów pozostaje bez wiarygodnego przypisania funkcji; zaznaczamy to w raporcie.

Co otrzymujesz

Wyniki przekazujemy w formatach, które da się otworzyć bez znajomości bioinformatyki, oraz równolegle w formatach nadających się do dalszej analizy programistycznej. Poniżej przykładowy zestaw plików dla projektu z jednym porównaniem — konkretna lista zależy od zakresu analizy i ustalamy ją w wycenie.

Jak taki komplet wygląda w praktyce, pokazujemy na przykładowej analizie RNA-Seq odpowiedzi Arabidopsis na suszę — na danych symulowanych, ale w formacie i zakresie takim, jaki dostajesz w realnym projekcie.

Plik	Format	Co zawiera
multiqc_report.html	HTML	Zbiorczy raport jakości wszystkich próbek — otwierany w przeglądarce. Liczba odczytów przed i po przycinaniu, dla każdej próbki Procent odczytów zmapowanych, unikalnych i wielokrotnie mapujących Rozkłady jakości, zawartość GC, poziom duplikacji
counts_raw.tsv	TSV	Macierz surowych zliczeń: wiersze to geny, kolumny to próbki. Punkt wyjścia do każdej ponownej analizy statystycznej. Kolumna 1: identyfikator genu (np. AT1G01010 lub ENSG00000141510) Kolejne kolumny: liczba odczytów przypisanych do genu w danej próbce
expression_TPM.xlsx	XLSX	Znormalizowane poziomy ekspresji, gotowe do przeglądania w Excelu. Zakładka „TPM": wartości znormalizowane na długość genu i głębokość biblioteki Zakładka „FPKM": alternatywna normalizacja, jeśli używasz jej w publikacji Kolumny opisowe: symbol genu, nazwa, opis funkcji
DE_results_<kontrast>.xlsx	XLSX	Główny plik wynikowy: pełna tabela ekspresji różnicowej, po jednej zakładce na porównanie. gene_id, symbol, description — identyfikacja i opis genu baseMean — średnia znormalizowana ekspresja we wszystkich próbkach log2FoldChange oraz lfcSE — kierunek i siła zmiany wraz z błędem standardowym pvalue, padj — istotność surowa i po korekcie Benjaminiego–Hochberga regulation — up / down / ns, według uzgodnionych progów Osobna zakładka „parameters" z wersjami narzędzi i użytymi progami
enrichment_GO_KEGG.xlsx	XLSX	Wyniki analizy wzbogacenia, osobno dla genów o podwyższonej i obniżonej ekspresji. Identyfikator i nazwa terminu GO lub szlaku KEGG Liczba genów z Twojej listy w terminie oraz w tle wartość p, wartość skorygowana i wartość q Pełna lista genów tworzących wzbogacenie
figures/	PNG + PDF	Wykresy w rozdzielczości publikacyjnej (PNG) oraz wektorowe (PDF/SVG) do dalszej edycji. PCA i mapa korelacji próbek Wykres volcano i wykres MA Mapa cieplna genów DEG Wykresy słupkowe i kropkowe wzbogacenia
alignments/.bam + .bai	BAM	Zmapowane odczyty z indeksami — możesz obejrzeć dowolny gen w przeglądarce genomu, np. IGV.
tracks/*.bw	bigWig	Ścieżki pokrycia znormalizowane do wielkości biblioteki, do wczytania w IGV lub JBrowse.
methods.docx	DOCX	Gotowy szkic sekcji „Materiały i metody" z wersjami wszystkich narzędzi, parametrami i cytowaniami — do wykorzystania w manuskrypcie.

Czego potrzebujemy od Ciebie

Surowe pliki FASTQ (spakowane gzip), najlepiej prosto z sekwenatora, bez wcześniejszego przycinania
Tabelę próbek: nazwa pliku, grupa eksperymentalna, powtórzenie, ewentualny batch
Gatunek i wersję genomu referencyjnego, jeśli masz preferencje — w przeciwnym razie dobierzemy aktualną
Opis pytania badawczego i porównań, które Cię interesują
Informację o typie biblioteki: sekwencjonowanie z jednego czy z dwóch końców (single-end / paired-end), niciowo-specyficzna (stranded) czy nie, poly(A) czy z deplecją rRNA

Sposób przekazania danych ustalamy indywidualnie — najczęściej otrzymujemy je na nośniku albo zakładamy dedykowane konto SFTP. Dane przetwarzamy na własnych serwerach oraz na serwerach wynajmowanych od renomowanych dostawców.

Wycena i współpraca

Każdy projekt wyceniamy indywidualnie. Koszt zależy przede wszystkim od liczby próbek, dostępności genomu referencyjnego, liczby porównań i zakresu analiz, o które prosisz.

Piszesz do nas, co chcesz zbadać i jakimi danymi dysponujesz.
Jeśli coś wymaga doprecyzowania, umawiamy krótką rozmowę — bezpłatnie i bez zobowiązań.
W ciągu 3–5 dni roboczych dostajesz wycenę wraz z zakresem prac, listą plików wynikowych i terminem realizacji.
Decydujesz. Wycena jest niezobowiązująca.

Czego się spodziewać

Dla orientacji: standardowa analiza RNA-Seq dla 10–20 próbek, od kontroli jakości po listę genów DEG wraz z analizą wzbogacenia GO i KEGG, to zwykle koszt rzędu 4 500 zł netto (ok. 1 100 EUR). Kwota zakłada organizm z dostępnym genomem referencyjnym i adnotacją, jedno lub dwa główne porównania oraz zestaw plików wynikowych opisany powyżej. Osobno wyceniamy między innymi składanie transkryptomu de novo, analizy izoform i splicingu, projekty wieloczynnikowe i serie czasowe.

Podane kwoty są orientacyjne, wyrażone w wartościach netto; do ceny doliczamy podatek VAT zgodnie z obowiązującymi przepisami. Nie stanowią one oferty w rozumieniu Kodeksu cywilnego. Więcej o zasadach współpracy w FAQ.

Analiza RNA-Seq